Высокопроизводительный конвейер по поиску биспецифических антител

Биология связи, том 6, Номер статьи: 380 (2023) Цитировать эту статью

6033 Доступа

1 Цитаты

11 Альтметрика

Подробности о метриках

Биспецифические антитела (BsAbs) представляют собой новый класс иммунотерапии, но неэффективность нынешнего открытия ограничила их широкую клиническую доступность. Здесь мы сообщаем о высокопроизводительном, независимом, функциональном скрининговом конвейере на основе отдельных клеток, включающем молекулярную и клеточную инженерию для эффективного создания клеток библиотеки BsAb с последующим функциональным опросом на уровне отдельных клеток для идентификации и сортировки положительных клонов и последующих последовательностей. идентификация и характеристика функциональности. Используя биспецифический захватчик Т-клеток CD19xCD3 (BiTE) в качестве модели, мы демонстрируем, что наша одноклеточная платформа обладает высокой эффективностью скрининга (до полутора миллионов вариантов клеток библиотеки за цикл) и может изолировать редкие функциональные клоны при низкой обилие 0,008%. Используя сложную библиотеку клеток, экспрессирующих CD19xCD3 BiTE, насчитывающую примерно 22 300 уникальных вариантов, включающих комбинаторно различные scFv, соединительные линкеры и ориентации VL/VH, мы идентифицировали 98 уникальных клонов, включая чрезвычайно редкие (обилие ~ 0,001%). Мы также обнаружили BiTE, которые демонстрируют новые свойства и возможности для разработки переменных предпочтений в отношении функциональности. Мы ожидаем, что наша одноклеточная платформа не только повысит эффективность открытия новых иммунотерапевтических препаратов, но и позволит определить обобщаемые принципы проектирования, основанные на глубоком понимании взаимосвязей между последовательностью, структурой и функцией.

Биспецифические антитела (BsAbs) представляют собой весьма привлекательный класс антител и иммунотерапевтических средств, обладающих большим потенциалом для лечения многих заболеваний, включая рак и аутоиммунитет1,2,3,4,5. Это неестественные биологические препараты, созданные для распознавания двух разных эпитопов одного и того же или разных целевых антигенов. BsAbs предлагают уникальные терапевтические способы действия, такие как активация и вовлечение иммунных клеток для уничтожения опухолевых клеток и одновременное воздействие на две синергические терапевтические мишени5,6,7,8. Таким образом, BsAbs могут демонстрировать превосходные терапевтические преимущества по сравнению с традиционными моноклональными антителами (mAbs) в отношении специфичности, эффективности, токсичности и лекарственной устойчивости. BsAb, активирующие Т-клетки (TAB), представляют собой самый крупный подкласс BsAb и составляют более 50% доклинических и клинических исследований BsAb9, включая клинически одобренный блинатумомаб (CD3xCD19), тебентафусп-тебн (CD3xGP100), мосунетузумаб (CD3xCD20) и теклистамаб (CD3xCD20). CD3xBCMA)9,10. TAB могут напрямую связывать Т-клетки и опухолевые клетки для уничтожения и обладают большим потенциалом для лечения многих типов рака. В настоящее время существует более 45 TAB на основе CD3, включая BCMAxCD3, Her2xCD3, CEAxCD3 и PSMAxCD3, которые проходят клинические испытания для лечения солидного и гематологического рака1,6. TAB могут быть созданы в нескольких форматах, включая биспецифические активаторы Т-клеток (BiTE), в которых используются тандемно связанные одноцепочечные вариабельные фрагменты (scFvs), нацеленные на эпитоп Т-клеток и опухолевый антиген, а также IgG с общей легкой цепью с полноразмерным конфигурация иммуноглобулина, где каждая вариабельная область тяжелой цепи нацелена либо на рецептор Т-клеток, либо на опухолевый антиген1,6.

К сожалению, разработка терапевтических BsAb, включая TAB, остается чрезвычайно сложным, медленным и дорогостоящим процессом, ограничивающим их клиническую доступность для широкого спектра заболеваний. Мы связываем это узкое место во многом со сложностью и неэффективностью существующих методов обнаружения BsAb. Обычный рабочий процесс обнаружения BsAb обычно начинается с характеристики пула связывающих mAb для двух соответствующих антигенов или эпитопов. Затем отбирается панель моноклональных антител для индивидуальной разработки вариантов BsAb путем объединения двух антигенсвязывающих доменов, полученных из каждого родительского моноклонального антитела, посредством гетеродимеризации субъединиц или прямого генетического слияния (например, BiTE)11,12,13,14,15,16,17, 18,19,20,21,22,23. Затем ограниченное количество вариантов BsAb экспрессируют, очищают и впоследствии тестируют индивидуально в анализе связывания с двойной мишенью и/или функциональном анализе для идентификации положительных клонов. Следует отметить, что, несмотря на то, что конструкция BsAb обычно начинается с двух заранее охарактеризованных связывающих антигены, интеграция их в функциональное BsAb является гораздо менее простой задачей. Действительно, активность связывания BsAb с его мишенями является лишь предпосылкой, которая не всегда трансформируется в функциональную активность. Например, эмицизумаб (клинически одобренный BsAb для лечения гемофилии А) был открыт методом «грубой силы», в ходе которого пришлось индивидуально экспрессировать, охарактеризовать и оптимизировать примерно 40 000 кандидатов11. В частности, для TAB функции активации Т-клеток и уничтожения опухолей образующихся BsAb решающим образом зависят от множества факторов, включая расположение эпитопа и расстояние до клеточной мембраны24,25,26,27,28,29, размера и плотности антигена27,28,29 ,30,31,32,33,34,35,36, аффинность связывания антитело/антиген31,32,33,34,35,37,38 размер, валентность, укладка, структурная ориентация и механика BsAbs, а также длина линкера и гибкость27,36,39,40,41,42. Хотя общепризнано, что небольшие различия в форматах и ​​характеристиках BsAb могут быть решающими факторами, определяющими функциональность, взаимосвязь между этими факторами сложна, и в настоящее время не существует общего принципа проектирования, который мог бы определять функциональность BsAb. Таким образом, на практике эта область опирается на процесс проб и ошибок, в котором BsAb эмпирически разрабатываются и конструируются из существующих связывающих моноклональных антител, а затем их функциональность должна оцениваться индивидуально. Этот традиционный подход, обычно включающий микротитровальный планшет и систему обработки жидкости, является предвзятым и значительно ограничивает скорость обнаружения BsAb, уровень успеха и время выполнения работ по определению терапевтического направления для дальнейшей разработки.