Пространственно разрешенная белковая карта интактных вирионов цитомегаловируса человека

Природная микробиология, том 8, страницы 1732–1747 (2023 г.) Процитировать эту статью

2389 Доступов

80 Альтметрика

Подробности о метриках

Вирусы герпеса собирают крупные частицы с оболочкой, структуру которых трудно охарактеризовать из-за их размера, хрупкости и сложного многослойного протеома с частично аморфной природой. Здесь мы использовали сшивочную масс-спектрометрию и количественную протеомику для получения пространственно разрешенной карты интерактома интактных вирионов цитомегаловируса человека. Это позволило de novo распределить 32 вирусных белка в четыре пространственно разделенных слоя вирионов, каждый из которых организован доминантным вирусным каркасным белком. Вирусный белок UL32 взаимодействует со всеми слоями в радиальной ориентации от N к C-концу, соединяя нуклеокапсид с вирусной оболочкой. Мы наблюдали специфическое включение 82 белков-хозяев, из которых 39 рекрутируются выборочно. Мы обнаружили, как UL32 за счет привлечения фосфатазы PP-1 противодействует связыванию белков 14-3-3. Этот механизм обеспечивает эффективный биогенез вируса, что указывает на возмущающую роль взаимодействия UL32-14-3-3. Наконец, мы интегрировали эти данные в крупнозернистую модель, чтобы получить глобальное представление о нативной конфигурации взаимодействий вируса и белка-хозяина внутри герпесвирионов.

Структурированная совокупность инфекционных частиц, называемая вирионами, имеет основополагающее значение для передачи вируса между клетками и организмами. Вирионы содержат геном нуклеиновой кислоты вируса, заключенный в оболочку капсидного белка. Ряд совместно упакованных белков облегчают процесс заражения и начало экспрессии вирусных генов. Герпесвирусы, семейство вирусов с двухцепочечной ДНК, собирают особенно большие и сложные частицы, содержащие множество различных белков, которые доставляются в клетку-хозяина при инфекции.

Способность герпесвирионов включать в себя большой набор белков обеспечивается их типичной многослойной архитектурой1. Внешняя липидная оболочка содержит различные вирусные гликопротеины, необходимые для связывания рецепторов клетки-хозяина и слияния мембран2. Пространство между оболочкой и центральным икосаэдрическим нуклеокапсидом заполнено белковым матриксом — тегументом. Хотя отдельные белки тегумента были распределены по разным внутренним и внешним подслоям на основе биохимических3 и микроскопических данных4,5, детали организации белков тегумента еще не изучены. Частицы герпесвируса также включают в себя многочисленные белки-хозяева, но очень немногие из этих явлений были охарактеризованы функционально или механически6,7.

Недавние исследования герпесвирионов с помощью криогенной электронной микроскопии (криоЭМ) выявили субструктуры нуклеокапсида8,9, портала10,11 и нескольких гликопротеиновых комплексов2,12,13. Кроме того, предыдущие исследования дали представление только об общем белковом составе герпесвирионов, идентифицировав от 46 до 82 вирусных белков14,15,16,17,18. Однако систематическая характеристика пространственной координации и взаимодействия белков вируса и хозяина внутри вирионов отсутствует.

Здесь мы используем сшивочную масс-спектрометрию (XL-MS) для построения карты близости по всему вириону, состоящей из 32 вирусных белков и 82 белков-хозяев в интактных внеклеточных вирионах цитомегаловируса человека (ЦМВВ), крупнейшего вируса герпеса человека. Эти данные позволяют de novo распределить белки хозяина и вируса и их белок-белковые взаимодействия (PPI) по слоям вириона, что дает представление об организации подслоев тегумента. Мы обнаружили, что вирусный белок UL32 (также известный как pp150) действует как доминантный каркас, участвует в ИПП по всей частице и опосредует рекрутирование белков-хозяев, таких как белки 14-3-3 и протеинфосфатаза 1 (PP-1). . PP-1 противодействует связыванию 14-3-3 с UL32 и необходим для эффективного начала экспрессии вирусных генов и производства вирусного потомства. Таким образом, составив схему организации протеома в нативных герпесвирионах, мы обеспечиваем основу для структурного и функционального понимания важнейших ИПП.

0.75 in n = 2 biological replicates) in virions (bottom bar). d,e, Purified virions from recombinant mutant viruses harbouring alanine substitutions in the designated motifs were assessed for protein levels by immunoblotting. Representative experiments of n = 2 biological replicates are shown./p>91% of the protein copies inside a virus particle./p>

10 copies) be identified in both replicates. When a crosslink involved a lower-abundance protein (that is, <10 copies), we required that the crosslink be identified in only one of the replicates. The rationale is that this balances crosslink confidence for highly abundant proteins with sensitivity for low-abundance proteins. Second, PPIs were only reported when there were two unique crosslinks identified, giving a higher-confidence set of PPIs. To retain only host proteins incorporated into the particle, host proteins that did not directly link to viral proteins were removed. The filtered set of crosslinks is available in Supplementary Table 2. The list of the corresponding PPIs together with evidence from existing data is available in Supplementary Table 3. The XL-based PPI network was generated on the basis of interprotein crosslinks from Supplementary Table 2 and visualized using edge-weighted spring-embedded layout70 in Cytoscape v.3.7.2. Edge weighting was based on the number of identified interlinks between protein pairs. Additional crosslink networks between selected proteins were visualized using xiNET71./p>

0.75 were considered (from the Phospho (STY).txt table). The positions of individual phosphosites as identified from this experiment were used to map phosphosites on the UL32 amino acid sequence (Fig. 4c). Phosphosite SILAC ratios were also corrected for the protein-level SILAC ratios (from proteinGroups.txt) as quantified from an analysis of the whole-virion proteome without IMAC enrichment. Phosphosites were excluded when the corresponding phosphopeptide contained residues mutated in the SILK/RVxF motifs of UL32. Then, protein-level corrected phosphosite ratios were averaged (quantification in both replicates required)./p>0.6 were considered./p>

220 nm). These correspond to the median of diameters from the purified sample ± two times the standard deviation. The fraction of particles with diameters that fall below 160 nm, exceed 220 nm or fall in between are indicated for the non-cross-linked (d) or cross-linked (e) sample types. Purification results in more homogeneous particle diameters, enriching virions in the expected size range. Thus, our protocol captures the native configuration of the particles at relatively high sample purity. At least 367 particles were counted per condition./p>